一、認(rèn)識(shí)體外診斷
體外診斷(IVD)是指在人體外通過對人體的血液等組織及分泌物進(jìn)行檢測獲取臨床診斷信息的產(chǎn)品和服務(wù)，可提供80%左右的臨床診斷信息，目前，已經(jīng)成為人類疾病預(yù)防、診斷、治療日益重要的組成部分。
二、體外診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)
體外診斷試劑是按醫(yī)療器械管理要求的，包括在疾病的預(yù)測、預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察和健康狀態(tài)評價(jià)的過程中，用于人體樣本體外檢測的試劑、試劑盒、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等產(chǎn)品。可以單獨(dú)使用，也可以與儀器、器具、設(shè)備或者系統(tǒng)組合使用。
由于體外診斷試劑在人的體外診斷過程中的重要作用，NMPA（原cFDA）對體外診斷試劑的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有著嚴(yán)格的規(guī)定和要求，如準(zhǔn)確度，精密度，重復(fù)性，再現(xiàn)性，以及最低檢測限和靈敏度等。
三、體外診斷試劑的特別注意——微生物污染
微生物是造成體外診斷試劑污染的主要來源之一。如何預(yù)防微生物污染，保證檢測試劑的精確度？如何保證產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的品質(zhì)？
防腐劑為我們提供了有效的解決方案，它是一類能夠殺滅或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)，在液體試劑中發(fā)揮著重要的防腐作用。
四、防腐劑的作用機(jī)理
防腐劑是能夠殺滅或抑制微生物，特別是細(xì)菌和真菌生長的化學(xué)物質(zhì)。它不是殺菌劑，沒有很強(qiáng)的即時(shí)殺滅效果，只有在足夠濃度并與微生物直接接觸的情況下才能發(fā)揮作用。通過作用于微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及酶等多個(gè)靶點(diǎn)，破壞細(xì)胞的分裂，抑制微生物的生長和繁殖，達(dá)到防腐的目的。實(shí)際上，防腐劑主要是對酶活力或?qū)?xì)胞原生質(zhì)部分的遺傳微粒結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的。例如，硫柳汞作用于巰基酶，而慶大霉素則作用于核糖體。總之，防腐劑是通過抑制細(xì)胞中基礎(chǔ)代謝酶的合成或重要生命物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)的合成，起到阻礙細(xì)胞生長的作用。
五、防腐劑的一般選擇原則
防腐劑的種類很多，如酸堿及其鹽類、中性化合物類、汞化合物類、季胺化合物類等。防腐劑對微生物繁殖體有殺滅作用，但對芽孢則使其不能發(fā)育為繁殖體而逐漸死亡。不同類型的防腐劑其作用機(jī)理也不盡相同，如醇類能使病原微生物蛋白質(zhì)變性；苯甲苯酸、尼泊金類等則能與病原微生物酶系統(tǒng)結(jié)合，競爭其輔酶；陽離子表面活性劑等則是通過降低表面張力作用，增加菌體細(xì)胞膜的通透性。
優(yōu)良的防腐劑應(yīng)具備以下特性：
① 加入防腐劑應(yīng)能有效抑制在試劑盒制備、保存和使用過程中最有可能污染的一種或多種微生物的生長；防腐劑應(yīng)對大多數(shù)細(xì)菌、真菌及酵母有較強(qiáng)的抑制作用；
② 防腐劑在試劑中有足夠的溶解度，以保證其在兩相或多相體系的試劑中具有足夠濃度；
③ 在試劑盒的有效期內(nèi)，防腐劑應(yīng)非常穩(wěn)定，不會(huì)因化學(xué)降解或揮發(fā)而降低濃度；防腐劑本身的理化性質(zhì)和抗微生物性質(zhì)應(yīng)穩(wěn)定，不易受熱和樣品pH值的影響，在長期貯存時(shí)不分解失效、不揮發(fā)，不沉淀，不與包裝材料起作用；
④ 防腐劑不與試劑盒中的任何成分發(fā)生反應(yīng)，不會(huì)影響試劑盒的檢測效果或防腐劑的效果；
⑤ 使用成本低，容易獲得。
六、常用的防腐劑分類
1、疊氮鈉(sodiumazide．NaN3)
疊氮鈉是體外診斷試劑中最常用的防腐劑之一，可抑制細(xì)菌生長，溶于水、液氨，不溶于乙醚，微溶于乙醇，用量一般為0.1%一0.5%。
疊氮鈉優(yōu)缺點(diǎn)：
多數(shù)情況下行之有效，但由于其含有氨基，會(huì)干擾辣根過氧化物酶(HRP)、超氧化物歧化酶、觸酶等多種酶，所以一般含有HRP的試劑都不建議使用。同理，一般不用于抗體及酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本保存。
另外，它能阻斷細(xì)胞的電子傳遞鏈，對許多生物體都有毒性，因此也不適用于活體實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，疊氮鈉與氰化物相似，屬于劇毒化合物，半數(shù)致死量為27mg/kg(大鼠，經(jīng)口)，對細(xì)胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使體內(nèi)氧合血紅蛋白形成受阻，有顯著的降壓作用。急性中毒出現(xiàn)頭暈、頭痛、全身無力、血壓下降、心動(dòng)過緩和昏迷。除對眼和皮膚有刺激性外，還可經(jīng)吸入、口服或皮膚吸收引起中毒死亡，而且遇高熱或劇烈震動(dòng)能強(qiáng)烈爆炸，使用時(shí)應(yīng)十分注意安全。出于安全方面的考慮，疊氮鈉的使用日益受限。
2、硫柳汞(thiomersalatum，C9H902HgNaS)
硫柳汞作為防腐劑已有60多年歷史，曾廣泛用于生物制品中的疫苗及體外診斷試劑。硫柳汞稍有特殊臭味，微有引濕性，遇光易變質(zhì)，易溶于水、乙醇，不溶于乙醚和苯，用量為0.001%～0.01%。它對革蘭陽性和陰性菌均有很強(qiáng)的抑菌能力，為廣譜抑菌劑。
硫柳汞優(yōu)缺點(diǎn)：
其作用機(jī)理為重金屬離子與菌體中酶蛋白的巰基結(jié)合而使酶失去活性，但對細(xì)菌抗原和血清蛋白的損害極其微弱，不能與酸、碘、鋁等重金屬鹽或生物堿配伍。
硫柳汞為含汞化學(xué)物質(zhì)，汞含量占到分子質(zhì)量的50%，代謝或降解產(chǎn)物為乙基汞和硫代水楊酸鹽，乙基汞是由二甲基汞降解的有機(jī)汞。由于少量有機(jī)汞在理論上具有神經(jīng)毒性，因此硫柳汞的使用安全問題深受人們關(guān)注。
3、慶大霉素(gentamicin，C21H43N507)
慶大霉素是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，是由22一脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成的多組分混合物，并以C族復(fù)合物為主。其作用機(jī)理是直接與30S核糖體亞單位16SrRNA解碼區(qū)的A部位結(jié)合，從而導(dǎo)至菌體死亡。
慶大霉素優(yōu)缺點(diǎn)：
它的抗菌譜較廣，對綠膿桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、克雷伯桿菌、奇異變形桿菌、某些吲哚變形桿菌、某些奈瑟菌、某些無色素雷桿菌和志賀菌等革蘭陰性菌有抗菌作用，對革蘭陽性菌中的金黃色葡萄球菌也有很強(qiáng)的抗菌作用。（梅里埃生產(chǎn)的HIV診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L硫酸慶大霉素和0.2ml/L肉桂醛。）
但抗生素的缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生耐藥性，Jakobsen等曾報(bào)道了120株對慶大霉素耐藥的大腸埃希菌的最小抑菌濃度(MIC)和耐藥機(jī)制的關(guān)系。
4、ProClin® 防腐劑（推薦使用）
ProClin是商品化的異噻唑啉酮類防腐劑，是2種異噻唑啉酮類化合物的混合物，并含有一定量的硝酸鎂及氯化鎂。此類防腐劑是非常高效的防腐劑，對各種細(xì)菌、霉菌、酵母及藻類有很強(qiáng)的抑制作用，使用濃度為0.1%～0.02%(活性成分約為1.5%)。其作用機(jī)理為2種活性成分在與細(xì)胞膜接觸幾分鐘后，可立即滲透到膜內(nèi)并抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性，從而抑制細(xì)胞生長代謝、大分子合成，引起細(xì)胞內(nèi)能量水平迅速下降；由于能量體系的崩潰，細(xì)胞不能合成日常代謝所需要的化合物，從而導(dǎo)至菌體死亡。
ProClin® 防腐劑優(yōu)缺點(diǎn)：
這類防腐劑能與氯及大多數(shù)陰、陽離子及非離子表面活性劑混溶，且在較高的使用濃度下不會(huì)影響酶活性。pH適用范圍廣(pH2～8.5)，化學(xué)穩(wěn)定性好。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測，在25℃下保存2年，該防腐劑的活性組分僅損失3％，與水可以任意比混合。ProClin®系列防腐劑具有多標(biāo)靶作用位點(diǎn)，因此大大降低了因變異產(chǎn)生的微生物的耐藥性，是一種理想的可替代硫柳汞、疊氮化鈉和慶大霉素的生物防腐劑。
但遇銨、亞硫酸鹽、強(qiáng)還原劑和強(qiáng)堿性會(huì)降低其活性，在過量使用下有一定的刺激性和致敏性。
下面我們將著重來講述ProClin®系列防腐劑。
為解決生物樣本處理過程中保存期短的問題，SUPELCO公司（現(xiàn)默克生命科學(xué)下屬的子品牌）推出新一代高效生物防腐劑ProClin™ 150，200，300，5000，可以有效地控制體外診斷試劑中微生物的生長。當(dāng)濃度達(dá)到0.02%條件下，ProClin®系列防腐劑具有廣譜抗菌活性，能在比較長的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌、真菌和酵母菌等微生物的生長；同時(shí)，它又能保持體系中酶的活性，因此它是一種理想的可替代硫汞撒、疊氮化鈉和慶大霉素等生物防腐劑。
目前，傳統(tǒng)的防腐劑由于劇毒、效率低的原因，已逐漸被新型防腐劑ProClin®防腐劑替代，并已被廣泛用于超過1000種FDA認(rèn)證的體外診斷試劑盒。
ProClin® 防腐劑的主要特點(diǎn)
• 廣譜抗菌性，作用速度極快
• 與主要的酶及誘導(dǎo)劑兼容
• 不影響抗體結(jié)合
• 易于使用的水溶性液體,在極低濃度下依然有效
• 在很大批的pH范圍內(nèi)也能保持極佳的穩(wěn)定性
• 使用HPLC即可測定活性組份(需要HPLC標(biāo)準(zhǔn)品)
• 在推薦使用濃度范圍內(nèi)，ProClin®不會(huì)引起任何危害健康、毒性及后處理問題
* 硫柳汞和疊氮化鈉為劇毒品，作為防腐劑使用會(huì)極大地危害人體健康。
ProClin® 系列防腐劑作用原理
ProClin®的主要活性組份為兩種異噻唑啉酮：
2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)；
5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)。
在與微生物接觸后的數(shù)分鐘內(nèi)，活性組份就能滲透過細(xì)胞壁從而抑制Krebs循環(huán)中某些特定酶的活性(如下圖紅色箭頭所示)。微生物的生長、大分子合成及呼吸鏈反應(yīng)被有效的抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ProClin®系列防腐劑具有多標(biāo)靶作用位點(diǎn)，因此大大降低了因變異產(chǎn)生的微生物的耐藥性。隨著KREBS循環(huán)被阻斷，細(xì)胞產(chǎn)生能量和合成酶等生物活性物質(zhì)的能力迅速下降，但其使用劑量卻保持比較低的水平對人畜無害。
